نمای کلی از الیزا

ELISA (سنجش ایمنی بدن مرتبط با آنزیم) چیست؟

ELISA (سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم) یک روش سنجش مبتنی بر صفحه است که برای تشخیص و تعیین کمیت مواد محلول مانند پپتیدها ، پروتئین ها ، آنتی بادی ها و هورمون ها طراحی شده است. از نامهای دیگر ، مانند آنزیم Immunoassay (EIA) نیز برای توصیف همان فناوری استفاده می شود. در یک ELISA ، آنتی ژن (ماکرومولکول هدف) بر روی یک سطح جامد (میکروپلیت) بی حرکت می شود و سپس با یک آنتی بادی که به آنزیم گزارشگر مرتبط است ، پیچیده می شود. تشخیص با اندازه گیری فعالیت آنزیم گزارشگر از طریق جوجه کشی با بستر مناسب برای تولید یک محصول قابل اندازه گیری انجام می شود. مهمترین عنصر ELISA یک تعامل آنتی بادی بسیار خاص آنتی ژن است.

مقاله زیر شما را از طریق تصمیمات و گزینه های ساخت ELISA راهنمایی می کند. همچنین می توانید از ابزار سازنده ELISA ما دیدن کنید ، به یک سری سؤال پاسخ دهید و توصیه هایی را ارائه دهید که در مورد این مؤلفه ها برای نیازهای منحصر به فرد ELISA شما بهتر کار می کنند.

محتویات صفحه

• قالب های الیزا (مستقیم ، ساندویچ و غیره)
• مستقیم در مقابل تشخیص غیرمستقیم استراتژی های ELISA
• الیزا رقابتی و قالب های دیگر (Elispot رقابتی و غیره)
• کیت های کامل و آماده برای استفاده ELISA

• انتخاب و پوشش صفحات ELISA
• صفحات ELISA از قبل روکش شده
• آنتی بادی های اولیه برای ELISA
• مسدود کردن بافر و بافر شستشو
• استراتژی های تشخیص برای ELISA

معرفی

روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) یک روش قدرتمند برای تشخیص و کمیت یک پروتئین خاص در یک مخلوط پیچیده است. در ابتدا توسط Engvall و Perlmann (1971) شرح داده شده است ، این روش تجزیه و تحلیل نمونه های پروتئین را با استفاده از آنتی بادی های خاص در چاه های میکروپلیت بی حرکت می کند. ELISA ها به طور معمول در صفحات پلی استایرن 96 چاه یا 384 چاه انجام می شوند که به طور منفعلانه آنتی بادی ها و پروتئین ها را به هم متصل می کنند. این الزام آور و بیحرکتی معرفهاست که باعث می شود ELISAS طراحی و انجام آن آسان شود. داشتن واکنش دهنده های ELISA که به سطح میکروپلیت بی حرکت می شود باعث می شود که در طول روش ، اتصال از مواد غیر محدود را آسان کنید. این توانایی در استفاده از آنتی بادی های با میل بالا و شستشوی مواد محدود غیر اختصاصی ، ELISA را به ابزاری قدرتمند برای اندازه گیری آنالیت های خاص در یک آماده سازی خام تبدیل می کند.

اگرچه بسیاری از انواع ELISA در موقعیت های مختلف توسعه یافته و مورد استفاده قرار گرفته است ، اما همه آنها به همان عناصر اساسی بستگی دارند:

1. پوشش/ضبط - بیحرکتی مستقیم یا غیرمستقیم آنتی ژن ها به سطح چاههای میکروپلیت پلی استایرن.
2. مسدود کردن صفحه redition پروتئین بی ربط یا سایر مولکول ها برای پوشاندن کلیه سایتهای اتصال سطح اشباع نشده چاههای میکروپلیت.
3. کاوشگر/تشخیص-انکوباسیون با آنتی بادی های اختصاصی آنتی ژن که به آنتی ژن ها متصل می شوند.
4. اندازه گیری سیگنال - تنظیم سیگنال تولید شده از طریق برچسب مستقیم یا ثانویه در آنتی بادی خاص.

شایع ترین برچسب های آنزیم پراکسیداز ترب کوهی (HRP) و قلیایی فسفاتاز (AP) است. از آنزیم های دیگر نیز استفاده شده است. این موارد شامل β-galactosidase ، استیل کولین استراز و کاتالاز است. انتخاب زیادی از بسترها برای انجام ELISA با کونژوگه HRP یا AP به صورت تجاری در دسترس است. انتخاب بستر بستگی به حساسیت سنجش مورد نیاز و ابزار دقیق در دسترس برای شناسایی سیگنال (اسپکتروفتومتر ، فلورومتر یا لومومومتر) دارد.

قالب های الیزا - مستقیم ، غیرمستقیم و ساندویچ الیزا

چندین قالب وجود دارد که برای ELISA استفاده می شود. اینها در روشهای ضبط مستقیم ، غیرمستقیم یا ساندویچ قرار می گیرند. مرحله اصلی بیحرکتی آنتی ژن مورد علاقه است که با جذب مستقیم به صفحه سنجش یا به طور غیرمستقیم از طریق یک آنتی بادی ضبط که به صفحه وصل شده است ، انجام می شود. سپس آنتی ژن به طور مستقیم (با برچسب آنتی بادی اولیه) یا به طور غیرمستقیم (مانند آنتی بادی ثانویه برچسب) تشخیص داده می شود. پرکاربردترین قالب سنجش ELISA سنجش ساندویچ الیزا است که به طور غیرمستقیم بی حرکت می کند و به طور غیرمستقیم حضور آنتی ژن هدف را تشخیص می دهد. این نوع سنجش ضبط یک روش "ساندویچ" نامیده می شود زیرا آنالیت برای اندازه گیری بین دو آنتی بادی اولیه محدود می شود ، هر کدام یک اپی توپ متفاوت از آنتی ژن را تشخیص می دهند - آنتی بادی ضبط و آنتی بادی تشخیص. فرمت ساندویچ الیزا به دلیل حساسیت و ویژگی آن بسیار مورد استفاده قرار می گیرد.

نمودار فرمت های مشترک الیزا (سنجش مستقیم در مقابل ساندویچ). در روش ، آنتی ژن مورد علاقه با جذب مستقیم به صفحه سنجش یا اولین بار آنتی بادی ضبط به سطح صفحه بی حرکت می شود. سپس تشخیص آنتی ژن را می توان با استفاده از یک آنتی بادی اولیه آنزیم کونژوگه شده (تشخیص مستقیم) یا یک مجموعه همسان از آنتی بادی های ثانویه اولیه و کونژوگه شده (تشخیص غیرمستقیم) انجام داد.

مستقیم در مقابل استراتژی های تشخیص غیرمستقیم ELISA

در بین قالب های سنجش استاندارد مورد بحث و نشان داده شده در بالا ، جایی که اختلاف در هر دو ضبط و تشخیص نگرانی بود ، مهم است که بین استراتژی های خاص که به طور خاص برای مرحله تشخیص وجود دارد ، تمایز قائل شود. صرف نظر از روشی که با استفاده از آن یک آنتی ژن در صفحه ضبط می شود (با جذب مستقیم به سطح یا از طریق آنتی بادی "ضبط" از پیش پوشش داده شده ، مانند یک ساندویچ ELISA) ، این مرحله تشخیص است (مانند تشخیص مستقیم یا غیرمستقیم) که تا حد زیادی حساسیت یک ELISA را تعیین می کند.

برخی از ویژگی های وب سایت ما روی مرورگر مورد استفاده شما کار نمی کند. لطفاً نسخه مرورگر خود را به روز کنید یا مرورگر دیگری را برای استفاده انتخاب کنید.

نمای کلی از ELISA مستقیم و تشخیص غیرمستقیم ELISA

استراتژی های مختلف برای ضبط و تشخیص در ELISA استفاده می شود. این ویدئو در مورد تفاوتهای اصلی بین روشهای مختلف به کار رفته بحث می کند.

روش تشخیص مستقیم از یک آنتی بادی اولیه با برچسب آنزیم گزارشگر یا برچسب استفاده می کند که مستقیماً با آنتی ژن واکنش نشان می دهد. تشخیص مستقیم را می توان با یک آنتی ژن که مستقیماً در صفحه سنجش یا با فرمت سنجش ضبط بی حرکت می شود ، انجام داد. تشخیص مستقیم ، در حالی که به طور گسترده در ELISA مورد استفاده قرار نمی گیرد ، برای رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی بافت ها و سلول ها کاملاً متداول است.

روش تشخیص غیرمستقیم از یک آنتی بادی ثانویه دارای برچسب یا یک مجموعه بیوتین-استرپتاویدین برای تقویت استفاده می کند و محبوب ترین قالب برای ELISA است. آنتی بادی ثانویه ویژگی آنتی بادی اولیه را دارد. در یک ساندویچ الیزا ، بسیار مهم است که آنتی بادی ثانویه فقط برای تشخیص آنتی بادی اولیه (و نه آنتی بادی ضبط) یا سنجش خاص برای آنتی ژن نیست. به طور کلی ، این با استفاده از ضبط و آنتی بادی های اولیه از گونه های مختلف میزبان (به عنوان مثال ، IgG موش و IgG خرگوش) حاصل می شود. برای سنجش ساندویچ ، استفاده از آنتی بادی های ثانویه که به صورت متقاطع برای حذف هرگونه آنتی بادی ثانویه که ممکن است میل به آنتی بادی ضبط داشته باشد ، مفید است.

مقایسه روشهای تشخیص مستقیم ، غیرمستقیم و ساندویچ ELISA

• سریع زیرا فقط یک آنتی بادی و مراحل کمتری استفاده می شود.
• واکنش متقابل آنتی بادی ثانویه از بین می رود.

• ایمن سازی آنتی بادی اولیه ممکن است با برچسب زدن با آنزیم ها یا برچسب های گزارشگر تأثیر منفی بگذارد.
• برچسب زدن آنتی بادی های اولیه برای هر سیستم خاص ELISA بسیار وقت گیر و گران است.
• تعداد محدودی آنتی بادی های اولیه کونژوگه شده از نظر تجاری موجود است.
• هیچ انعطاف پذیری در انتخاب برچسب آنتی بادی اولیه از یک آزمایش به دیگری.
• حداقل تقویت سیگنال.

• طیف گسترده ای از آنتی بادی های ثانویه دارای برچسب به صورت تجاری در دسترس هستند.
• همه کاره به دلیل اینکه بسیاری از آنتی بادی های اولیه را می توان در یک گونه ساخته کرد و همان آنتی بادی ثانویه دارای برچسب می تواند برای تشخیص استفاده شود.
• حداکثر ایمنی بودن آنتی بادی اولیه به دلیل برچسب زدن حفظ می شود.
• حساسیت افزایش می یابد زیرا هر آنتی بادی اولیه حاوی چندین اپی توپ است که می توانند توسط آنتی بادی ثانویه دارای برچسب محدود شوند و امکان تقویت سیگنال را فراهم می کنند.
• روشهای مختلف تشخیص را می توان با همان آنتی بادی اولیه (رنگ سنجی ، شیمی درمانی و غیره) استفاده کرد.

• واکنش متقاطع ممکن است با آنتی بادی ثانویه رخ دهد و در نتیجه سیگنال غیر اختصاصی ایجاد شود.
• یک مرحله جوجه کشی اضافی در این روش لازم است.

• بسیار حساس و بسیار خاص برای آنتی ژن هدف به عنوان دو آنتی بادی برای ضبط و تشخیص استفاده می شود.
• روشهای مختلف تشخیص را می توان با همان آنتی بادی ضبط استفاده کرد.

• برای شناسایی جفت های آنتی بادی و اطمینان از وجود واکنش متقاطع بین آنتی بادی های ضبط و تشخیص نیاز به بهینه سازی بیشتری دارد.

الیزا رقابتی و قالب های دیگر

علاوه بر قالب های استاندارد مستقیم و ساندویچ که در بالا توضیح داده شد ، چندین سبک دیگر ELISA وجود دارد:

ELISA رقابتی استراتژی است که معمولاً در هنگام کوچک بودن آنتی ژن مورد استفاده قرار می گیرد و تنها یک اپی توپ یا سایت اتصال آنتی بادی دارد. یکی از تنوع این روش شامل برچسب زدن آنتی ژن خالص به جای آنتی بادی است. آنتی ژن بدون برچسب از نمونه ها و آنتی ژن دارای برچسب برای اتصال به آنتی بادی ضبط رقابت می کنند. کاهش سیگنال از آنتی ژن خالص نشانگر وجود آنتی ژن در نمونه ها در مقایسه با چاههای سنجش با آنتی ژن دارای برچسب به تنهایی است.

برخی از ویژگی های وب سایت ما روی مرورگر مورد استفاده شما کار نمی کند. لطفاً نسخه مرورگر خود را به روز کنید یا مرورگر دیگری را برای استفاده انتخاب کنید.

نمای کلی از روش رقابتی ELISA

در ELISA رقابتی ، همچنین به عنوان مهار ELISA گفته می شود ، غلظت آنتی ژن هدف با تشخیص تداخل سیگنال تعیین می شود. آنتی ژن هدف در نمونه با یک مرجع برچسب خورده یا استاندارد برای اتصال به مقدار محدود آنتی بادی های بی حرکت در صفحه رقابت می کند.

Elispot (روش Immunospot مرتبط با آنزیم) به ضبط مانند ELISA و اندازه گیری پروتئین های ترشح شده توسط سلولهایی که در چاههای میکروپلیت با حیات PVDF اندود شده اند ، اشاره دارد. این یک روش "ساندویچ" است که در آن پروتئین ها به صورت محلی اسیر می شوند زیرا توسط سلولهای اندوه ترشح می شوند و تشخیص با یک بستر رسوب است. Elispot مانند وسترن بلات است که نتیجه آن نقاط بر روی سطح غشای است.

ELISA درون سلولی با سلولهایی انجام می شود که یک شبه در میکروپلاتهای استاندارد آبکاری شده و کشت داده می شوند. پس از ثابت شدن سلولهای کشت شده ، نفوذپذیری و مسدود شده ، پروتئین های هدف با آنتی بادی ها تشخیص داده می شوند. این یک روش غیرمستقیم است ، نه یک روش ساندویچ. آنتی بادی های ثانویه یا فلورسنت هستند (برای اندازه گیری مستقیم توسط یک خواننده صفحه فلورسنت یا میکروسکوپ) یا آنزیم کونژوگه (برای تشخیص با یک بستر محلول با استفاده از یک خواننده صفحه).

ELISA تقریباً همیشه با استفاده از صفحات و نمونه های پلی استایرن 96 چاه یا 384 چاه در محلول انجام می شود (به عنوان مثال ، مایعات بیولوژیکی ، محیط کشت یا لیزات سلول). این بستر مورد بحث در باقیمانده این مقاله است.

صفحات الیزا

پوشش صفحه از طریق جذب منفعل پروتئین به پلاستیک میکروپلیت سنجش حاصل می شود. این فرآیند هرچند تعامل آبگریز بین باقیمانده پروتئین پلاستیک و غیر قطبی رخ می دهد. اگرچه پروتئین های فردی ممکن است به شرایط خاص یا پیش درمانی برای اتصال بهینه نیاز داشته باشند ، متداول ترین روش برای صفحات پوشش شامل اضافه کردن محلول 2-10 میکروگرم بر میلی لیتر پروتئین حل شده در یک بافر قلیایی مانند نمک بافر فسفات (pH 7. 4) یا کربنات-بافر بی کربنات (pH 9. 4). این صفحه به مدت چند ساعت تا یک شب در دمای 4-37 درجه سانتیگراد انکوبه می شود. صفحات روکش شده بسته به پایداری پروتئین روکش شده ، می توانند بلافاصله یا خشک و در دمای 4 درجه سانتیگراد ذخیره شوند.

توجه به این نکته مهم است که شرایط پوشش بهینه و ظرفیت اتصال صفحه می تواند با هر پروتئین/آنتی بادی متفاوت باشد و باید به صورت تجربی تعیین شود. به استثنای ELISA های رقابتی، صفحات با پروتئین جذبی بیش از آنچه که در عمل می توان در طول آزمایش متصل شوند پوشانده شده اند تا بزرگترین محدوده کاری تشخیص ممکن را تسهیل کنند. برخی از پروتئین ها، به ویژه آنتی بادی ها، بهتر است روی صفحات در غلظتی کمتر از حداکثر ظرفیت اتصال پوشش داده شوند تا از اتصال غیراختصاصی در مراحل بعدی توسط پدیده ای به نام «قلاب کردن» جلوگیری شود. قلاب شدن از به دام افتادن پروتئین ها بین پروتئین های پوششی ناشی می شود که از شستشوی موثر و حذف پروتئین های غیرمجاز جلوگیری می کند. هنگامی که اتصال غیر اختصاصی تشخیص آنتی بادی های اولیه و ثانویه را به دام می اندازد، سیگنال پس زمینه بالایی به دست می آید، بنابراین نسبت سیگنال به نویز و حساسیت یک سنجش کاهش می یابد.

صفحات ELISA از قبل روکش شده

برای اکثر آنتی بادی ها و پروتئین ها، پوشش صفحات با جذب غیرفعال معمولاً خوب عمل می کند. با این حال، مشکلاتی می تواند از جذب غیرفعال ناشی شود، از جمله جهت گیری نامناسب، دناتوره شدن، راندمان ضعیف تثبیت، و اتصال آلاینده ها به همراه مولکول هدف. انواع مختلفی از صفحات از پیش روکش شده می توانند به کاهش این مشکلات کمک کنند. صفحاتی که از قبل با پروتئین A، G یا A/G پوشانده شده اند، می توانند به جهت گیری مناسب آنتی بادی ها کمک کنند و قابلیت اتصال آنتی ژن آنها را حفظ کنند. پروتئین های همجوشی را می توان با استفاده از صفحات پوشش داده شده با گلوتاتیون، کلات فلزی یا جذب آنتی بادی در جهت مناسب به یک میکروپلیت متصل کرد. پپتیدها و سایر مولکول های کوچک، که معمولاً با جذب غیرفعال به طور مؤثر متصل نمی شوند، می توانند بیوتینیله شوند و با کارایی بالا به صفحه پوشش دار پروتئین استرپتاویدین یا نوترآویدین متصل شوند. آنتی بادی های بیوتینیله شده را نیز می توان روی صفحاتی که از قبل با پروتئین های متصل شونده به بیوتین پوشانده شده اند، تثبیت کرد. استفاده از صفحات از قبل پوشش داده شده در این روش، آنتی ژن یا آنتی بادی را از سطح صفحه جدا می کند تا از اثرات دناتوره آن محافظت کند. سطوح با پوشش پلیمری و اصلاح شده می توانند برای کمک به افزایش جذب غیرفعال استفاده شوند. طیف گسترده ای از صفحات پوشش داده شده با عملکرد بالا (پیش پوشش داده شده و از پیش مسدود شده) در قالب های 96 چاهی و 384 چاهی (سیاه، شفاف یا سفید) وجود دارد. این میکروپلیت های پوشش داده شده را می توان برای توسعه ELISA و سایر سنجش های مبتنی بر صفحه با صفحه خوان های رنگ سنجی، فلورسانس یا لومینسانس شیمیایی مورد استفاده قرار داد.

انواع مختلف میکروپلیت برای الایزا

مثال زیر نشان می دهد که چگونه تغییرات در پوشش های پلیمری ممکن است ظرفیت های اتصال پروتئین را تحت تأثیر قرار دهد.

اتصال IgG بر روی سطوح اصلاح شده. معرفی گروه های عملکردی بر خصوصیات اتصال پلیمر پلاستیکی تأثیر می گذارد. این آزمایش نشان می دهد که تغییرات سطح بر اتصال پروتئین ها تأثیر می گذارد. مقایسه جذب پروتئین های مختلف بر روی کنترل غیر تحت درمان ، ترمو علمی Nunc Multisorp (سطح بسیار آبگریز) و MaxISORP (سطح آبگریز) صفحه های مسطح نشان دهنده اهمیت انتخاب سطح در بهینه سازی سنجش است. مولکول های مختلف بسته به ویژگی های سطح ، در رفتارهای کاملاً متفاوت رفتار می کنند. به عنوان مثال ، در شرایط اساسی ، IgG در مقایسه با یک صفحه کنترل غیر درمان شده ، پلی استایرن اصلاح شده با MaxISORP را با ظرفیت قابل توجهی بیشتر جذب می کند. در مورد MultIsORP ، گروه های عملکردی روی سطح ، جذب پروتئین IgG را محدود می کنند ، که با کاهش ظرفیت اتصال در مقایسه با صفحه غیر درمان شده مشهود است.

آنتی بادی های اولیه برای ELISA

از آنتی بادی های مونوکلونال یا پلی کلونال می توان به عنوان آنتی بادی های ضبط و تشخیص در ساندویچ الیزا و سایر سیستم های ELISA استفاده کرد. آنتی بادی های مونوکلونال دارای خاصیت ذاتی نسبت به یک اپی توپ واحد هستند که امکان تشخیص خوب و کمیت تفاوت های کوچک در آنتی ژن را فراهم می کند. آنتی بادی های پلی کلونال اغلب به عنوان آنتی بادی ضبط برای کاهش هرچه بیشتر آنتی ژن استفاده می شود. سپس از یک مونوکلونال به عنوان آنتی بادی تشخیص در روش ساندویچ استفاده می شود تا ویژگی بهبود یافته را فراهم کند. علاوه بر استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال سنتی ، آنتی بادی های مونوکلونال نوترکیب نیز ممکن است برای ELISA استفاده شود. آنتی بادی های نوترکیب از خطوط سلولی تولید کننده آنتی بادی برای بیان توالی DNA زنجیره ای سنگین و سبک آنتی بادی خاص گرفته می شوند. در مقایسه با آنتی بادی های مونوکلونال سنتی حاصل از هیبریدوما ، آنتی بادی های نوترکیب مستعد رانش خط سلول یا تنوع زیادی نیستند ، بنابراین ویژگی آنتی ژن اوج را امکان پذیر می کنند.

نکته مهم در طراحی ساندویچ الیزا این است که آنتی بادی های ضبط و تشخیص باید دو اپی توپ غیر همپوشانی مختلف را تشخیص دهند. هنگامی که آنتی ژن به آنتی بادی ضبط متصل می شود ، اپی توپ به رسمیت شناخته شده توسط آنتی بادی تشخیص نباید مبهم یا تغییر یابد. آنتی بادی های ضبط و تشخیص که با یکدیگر تداخل ندارند و می توانند همزمان به هم متصل شوند ، "جفت های همسان" نامیده می شوند و برای تهیه ساندویچ الیزا مناسب هستند. بسیاری از تأمین کنندگان آنتی بادی اولیه اطلاعاتی در مورد اپی توپ ها ارائه می دهند و جفت آنتی بادی هایی را نشان می دهند که در ELISA به عنوان جفت های همسان تأیید شده اند. استفاده از همان آنتی بادی برای ضبط و تشخیص می تواند دامنه پویا و حساسیت ELISA نهایی را محدود کند.

مسدود کردن بافر و بافر شستشو

ظرفیت اتصال چاههای میکروپلیت به طور معمول بالاتر از مقدار پروتئین پوشش داده شده در هر چاه است. برای جلوگیری از آنتی بادی ها یا پروتئین های دیگر از جذب به صفحه در مراحل بعدی ، سطح باقی مانده باید مسدود شود. بافر مسدود کننده محلول پروتئین بی ربط ، مخلوط پروتئین ها یا ترکیب دیگری است که به طور منفعل به تمام سطوح اتصال دهنده باقی مانده صفحه جذب می شود. اگر با کاهش حساسیت یک سنجش با کاهش سیگنال پس زمینه و بهبود نسبت سیگنال به نویز ، بافر مسدود کننده مؤثر باشد. بافر مسدود کننده ایده آل به کلیه سایتهای بالقوه تعامل غیر اختصاصی متصل می شود و پس زمینه را به طور کلی از بین می برد ، بدون اینکه اپی توپ را برای اتصال آنتی بادی تغییر داده یا مبهم کند.

هنگام توسعه هر ELISA جدید ، آزمایش چندین مسدود کننده مختلف برای بالاترین نسبت سیگنال به نویز در روش مهم است. بسیاری از عوامل می توانند بر اتصال غیر اختصاصی ، از جمله فعل و انفعالات مختلف پروتئین پروتئین منحصر به فرد برای نمونه ها و آنتی بادی های درگیر تأثیر بگذارند. مهمترین پارامتر هنگام انتخاب مسدود کننده ، نسبت سیگنال به نویز است که به عنوان سیگنال به دست آمده با یک نمونه حاوی آنالیت هدف نسبت به نمونه به دست آمده با نمونه بدون آنالیت هدف اندازه گیری می شود. استفاده از مقادیر ناکافی مسدود کننده منجر به پس زمینه بیش از حد و کاهش سیگنال به نویز می شود. استفاده از غلظت بیش از حد مسدود کننده ممکن است تعامل آنتی بادی-آنتی ژن را ماسک کند یا آنزیم را مهار کند ، مجدداً باعث کاهش نسبت سیگنال به نویز می شود. هیچ عامل مسدود کننده ای برای هر مناسبت ایده آل نیست و آزمایش تجربی برای بهینه سازی واقعی مرحله مسدود کردن ضروری است.

علاوه بر مسدود کردن ، انجام شستشوی کامل بین هر مرحله از ELISA ضروری است. مراحل شستشو برای از بین بردن معرفهای غیر محدود و کاهش پس زمینه ضروری است ، در نتیجه نسبت سیگنال به نویز افزایش می یابد. شستشوی کافی پیش زمینه بالایی خواهد داشت ، در حالی که شستشوی بیش از حد ممکن است منجر به کاهش حساسیت ناشی از شستشوی آنتی بادی و/یا آنتی ژن از چاه شود. شستشو در یک بافر فیزیولوژیکی مانند نمکی بافر تریس (TBS) یا نمک بافر فسفات (PBS) بدون هیچ گونه افزودنی انجام می شود. معمولاً یک ماده شوینده مانند 0. 05 ٪ Tween-20 به بافر اضافه می شود تا به حذف مواد غیر اختصاصی محدود کمک کند. یکی دیگر از تکنیک های رایج استفاده از محلول رقیق بافر مسدود کننده به همراه برخی مواد شوینده اضافه شده است. از جمله ماده مسدود کننده و اضافه کردن مواد شوینده در بافرهای شستشو به به حداقل رساندن پیش زمینه در سنجش کمک می کند. برای بهترین نتیجه ، از مواد شوینده با خلوص بالا برای جلوگیری از ایجاد ناخالصی که در سنجش چنین مهار کننده های آنزیم یا پراکسیدها اختلال ایجاد می کند ، استفاده کنید.

استراتژی های تشخیص برای ELISA

کروموژنیک (رنگ سنجی)	فلورسانس	شیمیایی
حساسیت
تجهیزات مورد نیاز	خواننده صفحه جذب استاندارد	فلورومتر سنج	خواننده صفحه چراغ
آنزیم	HRP یا AP	برچسب فلورسنت یا HRP (با بسترهای شیمیایی)	HRP یا AP
مزایای	تجسم مستقیم ، تکرارپذیری بالا بین صفحات	تکرارپذیری بالا بین صفحات ، دامنه پویا گسترده	بیشترین استراتژی تشخیص حساس ، دامنه پویا گسترده
ملاحظات	به میکروپلایت های سیاه نیاز دارد	به میکروپلیت های مات یا سیاه نیاز دارد

مرحله نهایی در تمام سیستم های الایزا مرحله تشخیص است. مگر اینکه از برچسب رادیواکتیو یا فلورسنت استفاده شود، این شامل معرفی یک سوبسترای آنزیمی است. آنزیم سوبسترا را به یک محصول قابل تشخیص تبدیل می کند. اگر یک ELISA به درستی ساخته و توسعه یافته باشد، آنگاه شدت سیگنال تولید شده در هنگام افزودن سوبسترا مستقیماً با مقدار آنتی ژنی که در پلیت گرفته شده و توسط معرف های تشخیص متصل می شود، متناسب خواهد بود. آنتی بادی های کونژوگه با آنزیم (به ویژه آنهایی که شامل پراکسیداز ترب کوهی، HRP) هستند، به دلیل تنوع بسترهای موجود برای تصویربرداری کروموژنیک، شیمی فلورسنت و نورتابی شیمیایی، بیشترین انعطاف را در روش های تشخیص و مستندسازی برای ELISA ارائه می دهند.

بسترهای رنگ سنجی یک محصول رنگی و محلول را تشکیل می دهند که در طول زمان نسبت به مقدار آنزیم موجود در هر چاه انباشته می شود. هنگامی که شدت رنگ مورد نظر به دست آمد، جذب محصول یا به طور مستقیم اندازه گیری می شود یا در برخی موارد یک محلول توقف اضافه می شود تا یک نقطه پایان ثابت برای سنجش فراهم شود. بسترهای رنگ سنجی برای پراکسیداز ترب کوهی (TMB، OPD، ABTS) و آلکالین فسفاتاز (PNPP) در دسترس هستند. اگرچه به اندازه بسترهای فلورسنت یا نورتابی شیمیایی حساس نیستند، بسترهای کروموژنیک ELISA اجازه تجسم مستقیم را می دهند و انجام مطالعات جنبشی را امکان پذیر می کنند. علاوه بر این، بسترهای ELISA کروموژنیک با صفحه خوان های استاندارد جذبی که در بسیاری از آزمایشگاه ها رایج است شناسایی می شوند.

مقایسه حساسیت زیرلایه های رنگ سنجی TMB مختلف ELISA برای HRP. TMB (3، 3'، 5، 5'-tetramethylbenzidine)، یک سوبسترای کروموژنیک رایج برای HRP، هنگامی که اکسید می شود، رنگ آبی ایجاد می کند. سپس رنگ با افزودن اسید سولفوریک یا فسفریک به زرد تغییر می کند، محلول های رایجی که برای توقف واکنش استفاده می شود. در نمودار سمت چپ، عملکرد چندین بستر TMB در یک سنجش صفحه ELISA مقایسه شده است.

شیمی درمانی یک واکنش شیمیایی است که انرژی آزاد شده به شکل نور تولید می کند. بیشتر بسترهای شیمیایی وابسته به HRP هستند ، اگرچه برخی از معادل AP در دسترس هستند. متداول ترین روش استفاده از لومینول در حضور HRP و یک بافر پراکسید است. لامپل اکسیده می شود و یک محصول حالت هیجان زده را تشکیل می دهد که نور را با پوسیدگی به حالت زمین ساطع می کند. انتشار نور فقط در طی واکنش آنزیم بستر رخ می دهد ، بنابراین وقتی بستر خسته می شود ، سیگنال متوقف می شود. تشخیص شیمیایی به طور کلی حساس تر از تشخیص رنگ سنجی است. یکی از اشکالات استفاده از بسترهای شیمیایی برای ELISA این است که شدت سیگنال می تواند بیشتر از سایر بسترها متفاوت باشد. برای سنجش هایی که نیاز به خواندن صفحات زیادی دارند ، در صورت شروع سیگنال قبل از خواندن صفحات ، می تواند مشکلی ایجاد کند. به همین دلیل ، مهم است که اطمینان حاصل شود که این روش با بستر بهینه شده است تا از تفسیر نادرست سیگنال در نمونه ای به وفور آنتی ژن کم جلوگیری شود. بسترهای شیمیایی برای HRP شامل بسترهای ELISA PICO Supeignal Thermo علمی و ELISA FEMTO است.

بسترهای ELISA فلورسنت به اندازه متداول نیستند و به فلورومتر نیاز دارند که پرتوی تحریک صحیح را ایجاد کند تا باعث انتشار سیگنال از برچسب فلورسنت شود. تشخیص شیمیایی نیز مبتنی بر آنزیم است ، اما محصول تولید شده به جای رنگ سنجی فلورسنت است. سیگنال با استفاده از یک فلورومتر با فیلترهای تحریک و انتشار مناسب اندازه گیری می شود. واکنشهای شیمیایی یازنی یا با گذشت زمان در سنجش جنبشی اندازه گیری می شوند یا با استفاده از محلول توقف برای اندازه گیری مستقیم متوقف می شوند. نمونه هایی از بسترهای شیمیایی برای HRP ، بسترهای کمیت و کوانتلوتای ترمو علمی هستند.

کیت های کامل و آماده برای استفاده ELISA

علاوه بر مؤلفه های فردی و اصول کلی ELISA که در این مقاله مورد بحث قرار گرفته است ، کیت های آماده برای استفاده ELISA برای تشخیص صدها سیتوکین خاص ، شیمیوکین ها ، فاکتورهای رشد ، آنالیت های عصبی و پروتئین های فسفریله شده در دسترس هستند که اهداف متداول هستندعلاقه تحقیق

برای بسیاری از اهداف ، دو نوع کیت در دسترس است:

• کیت های پوشش داده شده ELISA-حاوی صفحات آنتی بادی از پیش پوشش داده شده ، آنتی بادی های تشخیص ، بافر ، رقیق کننده ، استاندارد و بسترها. علاوه بر کیت های سنتی ELISA ، صفحات کیت فوری ELISA نیز موجود است که حاوی تمام اجزای لازم از جمله آنتی بادی ضبط و آنتی بادی تشخیص لیوفیلیزه ، استرپتویدین-HRP و رقیق کننده نمونه است. علاوه بر این ، چاههای نوار حاوی استاندارد برای منحنی استاندارد به طور جداگانه ارائه می شوند تا امکان استفاده کامل از 96 چاه برای نمونه های سنجش فراهم شود.

برای بزرگنمایی روی تصویر کلیک کنید

مقایسه فناوری فوری ELISA در مقابل روشهای معمولی ELISA. بر خلاف کیت های معمولی ELISA ، کیت های ELISA فوری Invitrogen تولید شد که شامل آنتی بادی ضبط و آنتی بادی تشخیص لیوفیلیزه و سایر معرفهای مورد نیاز برای توسعه ELISA باشد.

• کیت های بدون پوشش ELISA - این کیت ها با تمام معرفهای مورد نیاز برای پوشیدن صفحه خود و اجرای روش به استثنای محلول توقف و بافر شستشو می شوند.
• کیت های جفت آنتی بادی - این کیت ها حاوی آنتی بادی های همسان بهینه برای توسعه و استانداردهای ساندویچ ELISA (بدون صفحه یا معرفهای تشخیص) هستند.

این راهنمای انتخاب فرمت ELISA ویژگی های کیت های جفت آنتی بادی Invitrogen و کیت های ELISA را مقایسه می کند.

برخی از ویژگی های وب سایت ما روی مرورگر مورد استفاده شما کار نمی کند. لطفاً نسخه مرورگر خود را به روز کنید یا مرورگر دیگری را برای استفاده انتخاب کنید.

نمای کلی کیت های Invitrogen Elisa

این فیلم آموزشی نحوه استفاده از کیت های ELISA آماده استفاده از Invitrogen را نشان می دهد.